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基本信息
產品編號 71023
中文名稱 大腸桿菌DNA殘留定量檢測試劑盒
英文名稱
產品價格(元) 8600.00
備注 -20℃,避光,有效期12個月
包裝規(guī)格型號 100T/盒
適用標準 中國藥典
說明及用途 用于外源性DNA殘留量測定

產品詳情

大腸桿菌DNA殘留定量檢測試劑盒說明書
貨號:71023
 
一. 試劑盒簡介
大腸桿菌殘留 DNA 檢測試劑盒是用于定量檢測各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成品中殘留的大腸桿菌 宿主細胞DNA。本試劑盒利用熒光探針原理,定量檢測樣本中大腸桿菌殘留DNA檢測快速,專一性強,性能可靠,最低檢測限可以達到 fg 級別。試劑盒配套有大腸桿菌 DNA定量參考品,已溯源至國家標準品。
 
二.試劑盒組份
表 1.試劑盒組份
組份 裝量 數量 儲存條件
大腸桿菌 DNA 定量參考品 75ng/瓶 1瓶 -20℃
大腸桿菌 qPCR 檢測試劑
(熒光定量PCR試劑,含ROX校正染料)
680ul/瓶 3瓶 -20℃,避光
復溶液 1.5ml/瓶 3瓶 2-8℃及以下
 
?  規(guī)格:100 Reactions。
?  有效期: 規(guī)定儲存條件下 12 個月。

?  已測試機型:
?  PRISM? 7500 Real-Time PCR System (ABI)
?  CFX96 (Bio-Rad)
?  LineGene 9600 (博日)
?  Roche 480 Lightcycler
 
三、實驗所需但試劑盒中未含材料
?  1.5ml 無菌低吸附離心管
?  1000μl,100μl,10μl 無菌低吸附帶濾芯槍頭
?  相關設備
?  熒光定量 PCR 儀
?  1000μl,100μl,10μl 移液槍

四、操作流程
4.1大腸桿菌 DNA 定量參考品的稀釋和標準曲線的制備
將試劑盒中提供的 大腸桿菌 DNA凍干定量參考品75ng,使用 0.5ml 復溶液溶解 。之后按照如下步驟依次稀釋至濃度為 150ng/ml、15ng/ml、1.5ng/ml、0.15ng/ml、0.015ng/ml。
具體操作如下:
1.  向試劑盒中提供的 大腸桿菌 DNA 凍干品中加入 0.5mL DNA復溶液,蓋好膠塞,輕微振蕩混勻,此樣品為ST1。
2.  取 5 支干凈的 1.5ml 離心管,分別標記為 ST0 , ST2, ST3,ST4,ST5。
3.  每管分別加入 90μl DNA 復溶液。
4.  取 10μl 的  大腸桿菌 DNA 定量參考品 ST1,加入 ST2 管,瞬時振蕩混勻后短時間快速離心 5s,重復 3 次以確保定量參考品與 DNA復溶液充分混勻。
5.  按表 2 依次進行稀釋操作,稀釋步驟同 4。
 表 2. 大腸桿菌 DNA 定量參考品的稀釋
稀釋管 稀釋體積 濃度(ng/ml)
ST1 1瓶DNA 定量參考品+500μl DNA復溶液 150
ST2 10μl ST1+90μl DNA復溶液 15
ST3 10μl ST2+90μl DNA復溶液 1.5
ST4 10μl ST3+90μl DNA復溶液 0.15
ST5 10μl ST4+90μl DNA復溶液 0.015
ST0 90μl DNA 復溶液 0
已融化未使用的 DNA 復溶液可保存于 -20℃。
 
4.2 加樣回收質控 ERC 的制備
根據需要設置 ERC 中的  大腸桿菌 DNA 加樣濃度(以制備加0.15 ng/ml   大腸桿菌 DNA 量的樣本 ERC 為例),具體操作如下:
1.  取 100μl 待測樣本加入 1.5ml 干凈的離心管中。
2.  再加入 10μl ST3,混勻,標記為樣本 ERC。
   樣本 ERC 和同批待測樣本一起進行樣本前處理,制備成樣本 ERC 純化液。
 
4.3 陰性質控 NCS 的制備
根據實驗設置陰性質控,具體操作如下:
1. 取100μl 樣本基質溶液(或DNA 復溶液)加入 1.5ml 干凈的離心管中標記為陰性質控 NCS。
   陰性質控 NCS 和同批待測樣本一起進行樣本前處理,制備成陰性質控 NCS 純化液。
 
4.4 qPCR 反應液的制備和加樣
1.  根據所要檢測的標準曲線及待測樣本數量,計算所需反應孔數,一般做 3 個重復孔/樣。
反應孔數=(5 個濃度梯度的標準曲線+ 1 個無模板對照 NTC+ 1 個陰性質控 NCS +待測樣本×2)×3
   待測樣本×2 是因為我們推薦每個待測樣本檢測時都應同時做樣本ERC。
2.  從試劑盒內取出 大腸桿菌 qPCR 檢測試劑一管,室溫下使其完全融化。
3.  根據反應孔數計算本次所需的 大腸桿菌 qPCR MIX 總量:
      大腸桿菌 qPCR MIX =(反應孔數+1)× 20μl(含有 1 孔的損失量)
4.  各試劑置于冰上融化,輕微振蕩混勻,按表 3 所示加樣: 表 3.各反應孔加樣示例
標準曲線 20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl ST1/ST2/ST3/ST4/ ST5
NTC 20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl DNA 復溶液
NCS 20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl NCS 純化液
待測樣本 20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl 待測樣本純化液
樣本 ERC 20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl 樣本 ERC 純化液
 
   加樣完成后每孔總體積為 25μl。,檢測試劑含有ROX染料。
 
NTC   S1 S1 S1 S1 ERC S1 ERC S1 ERC         A
NTC   S2 S2 S2 S2 ERC S2 ERC S2 ERC   ST5 ST5 ST5 B
NTC   S3 S3 S3 S3 ERC S3 ERC S3 ERC   ST4 ST4 ST4 C
    S4 S4 S4 S4
ERC
S4
ERC
S4
ERC
  ST3 ST3 ST3 D
NCS   S5 S5 S5 S5 ERC S5 ERC S5 ERC   ST2 ST2 ST2 E
NCS                 ST1 ST1 ST1 F
NCS                       G
                        H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12  
 
   該示例表示的是檢測5 個濃度梯度的 大腸桿菌 DNA 標準曲線(ST1~ST5)、1 個無模板對照 NTC、1 個陰性質控 NCS、5 個待測樣本(S1~S5)和每個樣本的 ERC(S1 ERC~S5 ERC)。每個檢測做 3 個重復孔。
   實際檢測時可根據樣本多少,參照此示例進行 96 孔板排版加樣。
5.  將 96 孔板用光學膜封閉,輕微震蕩混勻,短時間快速離心 10s 后放入 qPCR 儀。
 
五.qPCR 程序參數設置
以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 12.4 3 為例。
1.  創(chuàng)建空白新程序,選擇絕對定量檢測模板。
2.  創(chuàng)建新檢測探針,命名為  大腸桿菌-DNA,選擇報告熒光基團為FAM,猝滅熒光基團為 none,檢測參比熒光為 ROX。
3.  設置兩步法反應程序:95℃預變性 10min;95℃ 30 s,60℃ 1 min,40 個循環(huán);反應體積 25μl 。
 
 
六. qPCR 結果分析
   以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 12.4 3 為例。
1.  在 Results 的 Amplification Plot 面板中,將 Threshold 設置為 0.02,點擊 Analyze,此時可初步查看擴增曲線的形態(tài)是否正常。
2.  在 Results 的 Plate 面板中,將標準曲線孔的 Task 一欄設置為Standard,并且在 Quantity 一欄分別賦值為15030ng/ml、153ng/ml、1.50.3ng/ml、0.150.03ng/ml、0.0030.015ng/ml,并且在相應的 Sample Name 一欄中命名為 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
3.  在 Results 的 Plate 面板中,將無模板對照 NTC 孔的 Task 一欄設置為 NTC,將陰性質控 NCS 孔、待測樣本孔、樣本 ERC 孔的Task 一欄設置為 Unknown,并且在相應的 Sample Name 一欄
中命名為 NTC、NCS、S、ERC,之后點擊 。
4.  在 Results 的 Standard Curve 面板中,可讀取標準曲線的斜率(Slope)、截距(Intercept)、R2。
5.  在 Results 的 Report 面板中,Mean Quantity 一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質控 NCS、待測樣本、樣本 ERC 的檢測值, 單位為ng/ml。后續(xù)可在檢測報告中將單位換算為 pg/μl 或pg/ml。
七.其他  
結果分析的參數設置需依據具體的機型及使用的軟件版 本,一般也可由儀器自動判讀。
    根據待測樣本和樣本 ERC 的檢測結果計算加樣回收率, 加樣回收率要求在 50%~150%之間。
   陰性質控 NCS 的 Ct 值應大于標曲最低濃度 Ct 均值。
   無模板對照 NTC 的檢測結果應為 Undetermined 或 Ct 值≥35。