大腸桿菌DNA殘留定量檢測試劑盒說明書
貨號：71023
一. 試劑盒簡介
大腸桿菌殘留 DNA 檢測試劑盒是用于定量檢測各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成品中殘留的大腸桿菌 宿主細胞DNA。本試劑盒利用熒光探針原理，定量檢測樣本中大腸桿菌殘留DNA檢測快速，專一性強，性能可靠，最低檢測限可以達到 fg 級別。試劑盒配套有大腸桿菌 DNA定量參考品，已溯源至國家標準品。
二．試劑盒組份
表 1.試劑盒組份
| 組份 |
裝量 |
數量 |
儲存條件 |
| 大腸桿菌 DNA 定量參考品 |
75ng/瓶 |
1瓶 |
-20℃ |
大腸桿菌 qPCR 檢測試劑
（熒光定量PCR試劑，含ROX校正染料） |
680ul/瓶 |
3瓶 |
-20℃，避光 |
| 復溶液 |
1.5ml/瓶 |
3瓶 |
2-8℃及以下 |
? 規(guī)格：100 Reactions。
? 有效期: 規(guī)定儲存條件下 12 個月。
?
? 已測試機型：
? PRISM? 7500 Real-Time PCR System (ABI)
? CFX96 (Bio-Rad)
? LineGene 9600 (博日)
? Roche 480 Lightcycler
三、實驗所需但試劑盒中未含材料
? 1.5ml 無菌低吸附離心管
? 1000μl，100μl，10μl 無菌低吸附帶濾芯槍頭
? 相關設備
? 熒光定量 PCR 儀
? 1000μl，100μl，10μl 移液槍
?
四、操作流程
4．1大腸桿菌 DNA 定量參考品的稀釋和標準曲線的制備
將試劑盒中提供的 大腸桿菌 DNA凍干定量參考品75ng,使用 0.5ml 復溶液溶解 。之后按照如下步驟依次稀釋至濃度為 150ng/ml、15ng/ml、1.5ng/ml、0.15ng/ml、0.015ng/ml。
具體操作如下：
1. 向試劑盒中提供的 大腸桿菌 DNA 凍干品中加入 0.5mL DNA復溶液，蓋好膠塞，輕微振蕩混勻，此樣品為ST1。
2. 取 5 支干凈的 1.5ml 離心管，分別標記為 ST0 ， ST2， ST3，ST4，ST5。
3. 每管分別加入 90μl DNA 復溶液。
4. 取 10μl 的 大腸桿菌 DNA 定量參考品 ST1，加入 ST2 管，瞬時振蕩混勻后短時間快速離心 5s，重復 3 次以確保定量參考品與 DNA復溶液充分混勻。
5. 按表 2 依次進行稀釋操作，稀釋步驟同 4。
表 2. 大腸桿菌 DNA 定量參考品的稀釋
| 稀釋管 |
稀釋體積 |
濃度(ng/ml) |
| ST1 |
1瓶DNA 定量參考品+500μl DNA復溶液 |
150 |
| ST2 |
10μl ST1+90μl DNA復溶液 |
15 |
| ST3 |
10μl ST2+90μl DNA復溶液 |
1.5 |
| ST4 |
10μl ST3+90μl DNA復溶液 |
0.15 |
| ST5 |
10μl ST4+90μl DNA復溶液 |
0.015 |
| ST0 |
90μl DNA 復溶液 |
0 |
已融化未使用的 DNA 復溶液可保存于 -20℃。
4.2 加樣回收質控 ERC 的制備
根據需要設置 ERC 中的 大腸桿菌 DNA 加樣濃度（以制備加0.15 ng/ml 大腸桿菌 DNA 量的樣本 ERC 為例），具體操作如下：
1. 取 100μl 待測樣本加入 1.5ml 干凈的離心管中。
2. 再加入 10μl ST3，混勻，標記為樣本 ERC。
樣本 ERC 和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成樣本 ERC 純化液。
4.3 陰性質控 NCS 的制備
根據實驗設置陰性質控，具體操作如下：
1. 取100μl 樣本基質溶液(或DNA 復溶液)加入 1.5ml 干凈的離心管中標記為陰性質控 NCS。
陰性質控 NCS 和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成陰性質控 NCS 純化液。
4.4 qPCR 反應液的制備和加樣
1. 根據所要檢測的標準曲線及待測樣本數量，計算所需反應孔數，一般做 3 個重復孔/樣。
反應孔數=（5 個濃度梯度的標準曲線+ 1 個無模板對照 NTC+ 1 個陰性質控 NCS +待測樣本×2）×3
待測樣本×2 是因為我們推薦每個待測樣本檢測時都應同時做樣本ERC。
2. 從試劑盒內取出 大腸桿菌 qPCR 檢測試劑一管，室溫下使其完全融化。
3. 根據反應孔數計算本次所需的 大腸桿菌 qPCR MIX 總量：
大腸桿菌 qPCR MIX =（反應孔數+1）× 20μl（含有 1 孔的損失量）
4. 各試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按表 3 所示加樣： 表 3.各反應孔加樣示例
| 標準曲線 |
20μl 大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl ST1/ST2/ST3/ST4/ ST5 |
| NTC |
20μl 大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl DNA 復溶液 |
| NCS |
20μl 大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl NCS 純化液 |
| 待測樣本 |
20μl 大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl 待測樣本純化液 |
| 樣本 ERC |
20μl 大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl 樣本 ERC 純化液 |
加樣完成后每孔總體積為 25μl。，檢測試劑含有ROX染料。
| NTC |
|
S1 |
S1 |
S1 |
S1 ERC |
S1 ERC |
S1 ERC |
|
|
|
|
A |
| NTC |
|
S2 |
S2 |
S2 |
S2 ERC |
S2 ERC |
S2 ERC |
|
ST5 |
ST5 |
ST5 |
B |
| NTC |
|
S3 |
S3 |
S3 |
S3 ERC |
S3 ERC |
S3 ERC |
|
ST4 |
ST4 |
ST4 |
C |
| |
|
S4 |
S4 |
S4 |
S4
ERC |
S4
ERC |
S4
ERC |
|
ST3 |
ST3 |
ST3 |
D |
| NCS |
|
S5 |
S5 |
S5 |
S5 ERC |
S5 ERC |
S5 ERC |
|
ST2 |
ST2 |
ST2 |
E |
| NCS |
|
|
|
|
|
|
|
|
ST1 |
ST1 |
ST1 |
F |
| NCS |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
G |
| |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
| 1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
該示例表示的是檢測5 個濃度梯度的 大腸桿菌 DNA 標準曲線（ST1～ST5）、1 個無模板對照 NTC、1 個陰性質控 NCS、5 個待測樣本（S1～S5）和每個樣本的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每個檢測做 3 個重復孔。
實際檢測時可根據樣本多少，參照此示例進行 96 孔板排版加樣。
5. 將 96 孔板用光學膜封閉，輕微震蕩混勻，短時間快速離心 10s 后放入 qPCR 儀。
五．qPCR 程序參數設置
以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 12.4 3 為例。
1. 創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。
2. 創(chuàng)建新檢測探針，命名為 大腸桿菌-DNA，選擇報告熒光基團為FAM，猝滅熒光基團為 none，檢測參比熒光為 ROX。
3. 設置兩步法反應程序：95℃預變性 10min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，40 個循環(huán)；反應體積 25μl 。
六. qPCR 結果分析
以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 12.4 3 為例。
1. 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，將 Threshold 設置為 0.02，點擊 Analyze，此時可初步查看擴增曲線的形態(tài)是否正常。
2. 在 Results 的 Plate 面板中，將標準曲線孔的 Task 一欄設置為Standard，并且在 Quantity 一欄分別賦值為15030ng/ml、153ng/ml、1.50.3ng/ml、0.150.03ng/ml、0.0030.015ng/ml，并且在相應的 Sample Name 一欄中命名為 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
3. 在 Results 的 Plate 面板中，將無模板對照 NTC 孔的 Task 一欄設置為 NTC，將陰性質控 NCS 孔、待測樣本孔、樣本 ERC 孔的Task 一欄設置為 Unknown，并且在相應的 Sample Name 一欄
中命名為 NTC、NCS、S、ERC，之后點擊 。
4. 在 Results 的 Standard Curve 面板中，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5. 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質控 NCS、待測樣本、樣本 ERC 的檢測值， 單位為ng/ml。后續(xù)可在檢測報告中將單位換算為 pg/μl 或pg/ml。
七．其他
結果分析的參數設置需依據具體的機型及使用的軟件版 本，一般也可由儀器自動判讀。
根據待測樣本和樣本 ERC 的檢測結果計算加樣回收率， 加樣回收率要求在 50%～150%之間。
陰性質控 NCS 的 Ct 值應大于標曲最低濃度 Ct 均值。
無模板對照 NTC 的檢測結果應為 Undetermined 或 Ct 值≥35。
